L'électrophorèse en gel d'agarose est une méthode utilisée en biochimie et en biologie moléculaire pour séparer l'ADN, l'ARN ou des protéines selon leur poids moléculaire.

La technique de l'électrophorèse en gel d'agarose est basée sur la séparation des acides nucléiques chargés négativement sous l'effet d'un champ électrique. Cette séparation s'effectue à travers la matrice du gel d'agarose : les molécules de plus petites tailles se déplacent plus rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles supérieures^[1].

Applications

• Estimation du poids moléculaire de fragment d'ADN après une digestion par des enzymes de restriction
• Analyse d'ADN ou d'ARN après une augmentcation par PCR
• Séparation de fragments ADN digérés avant Southern blot ou d'ARN dans le cas de Northern Blot.

Les avantages de l'électrophorèse en gel d'agarose sont les suivants :

• préparation aisée, rapide, et peu coûteuse des gels d'agarose
• pas de dénaturation des échantillons
• l'agarose plus ferme et moins toxique que le gel de polyacrylamide
• les échantillons peuvent être récupérés en vue d'analyses supplémentaires

Facteurs affectant la migration

Le facteur principal est la longueur de la molécule d'ADN : la séparation se fait selon le poids moléculaire et par conséquent de la taille de l'ADN. Cependant la conformation de l'ADN est aussi un facteur important. Ainsi pour éviter les problèmes liés à cette conformation, n'est scindé sur gel d'agarose seulement que de l'ADN linéaire (fragment d'ADN issu d'une digestion, ADN augmenté par PCR ou encore de l'ADNc).

L'augmentation de la concentration d'agarose dans un gel diminué la vitesse de migration et permet la séparation de fragment d'ADN de plus petite taille. Plus le voltage est important, plus la vitesse de migration augmente. Cependant le voltage est limité en intensité, effectivement un fort voltage induit une augmentation de température ce qui peut faire fondre le gel.

La conformation d'ADN plasmidique, non digéré par une enzyme de restriction, migre à différentes vitesses (du plus lent au plus rapide)  : ADN circulaire, ADN linéaire et ADN superenroulé.

Gel d'agarose

On utilise le plus souvent un gel 1% m/v (1 g d'agarose pour 100 ml de volume final) en électrophorèse. Plus on veut un gel discriminant, plus on augmentera le pourcentage d'agarose.

Agarose

L'agarose est un polymère à base d'agar purifié. Différentes puretés d'agarose sont disponibles auprès des fournisseurs. Généralement, de l'agarose de grande pureté à la solidification lente est utilisé quand l'ADN doit être extrait du gel après migration.

Tampons

Il existe un nombre particulièrement varié de tampons. Les plus fréquemment utilisés sont le Tris/Acétate/EDTA (TÆ), le Tris/Borate/EDTA (TBE) et le sodium borate (SB).

Le TÆ possède le plus faible pouvoir tampon mais produit une meilleure séparation pour les fragments d'ADN de grande taille.
Le SB est assez nouveau et inefficace pour la séparation de fragments d'ADN d'une taille supérieure à 5000 paires de bases (5 kb). Cependant sa faible conductivité permet l'utilisation d'un plus fort voltage (jusqu'à 35V/cm), ceci réduisant énormément le temps de migration.

Des fragments d'ADN avec uniquement quelques paires de bases de différences sont scindés en utilisant un gel d'agarose à 3% et avec un tampon SB de très faible conductivité (1 mM lithium borate). ^[2]

Préparation

Exemple pour un mini-gel de 50 ml conçu pour séparer des fragments de 2 à 5 kb

• Préparer le moule et le peigne appropriés au nombre et au volume des échantillons à séparer.
• Préparer suffisamment de tampon (TÆ, TBE) pour remplir la cuve (par exemple 200 ml) et préparer le gel (50 ml).
• Dans une fiole Erlenmeyer, peser la quantité d'agarose déterminée selon le tableau suivant et selon la taille des fragments à séparer :

Pouvoir de séparation d'ADN linéaire, double brin, selon la concentration d'agarose du gel^[3]

Concentration d'agarose (% en M/V)	Gamme de tailles parfaites (en kb)
0.3	5 – 60
0.6	1 – 20
0.7	0.8 – 10
0.9	0.5 – 7
1.2	0.4 – 6
1.5	0.2 – 3
2.0	0.1 – 2

• Pour l'exemple, il faudra par conséquent fondre 600 mg d'agarose dans 50 ml de tampon : concentration finale de 1.2%, parfaite pour séparer des fragments de 0.6 à 6 kb.
• Dissoudre totalement l'agarose dans le tampon, en plaçant l'Erlenmeyer soit au four à micro-ondes, soit toujours dans un bain marie d'eau bouillante, et en agitant de temps à autre. L'agarose est complètement dissout quand les grains, originellement visibles sous forme de petites lentilles, ont totalement disparu.
• Mettre sous agitation et laisser refroidir, ou placer dans un bain-marie à à peu près 50°C (température supportable au toucher). Peut-être, refroidir plus rapidement en laissant couler un filet d'eau froide le long de l'Erlenmeyer, en agitant constamment. Il est spécifiquement important de refroidir l'agarose en dessous de 60°C lors de l'utilisation de moules en PMMA, qui risquent sinon de fondre.
• Si désiré, du bromure d'éthidium peut désormais être rajouté, à une concentration finale de 0.5 µg/ml. Il est cependant déconseillé d'ajouter à la place du bromure d'éthidium certains autres révélateurs (par exemple du SYBR Gold, un fluorophore identique au (SYBR Green I) directement dans le gel, car ceux-ci peuvent affecter la mobilité des acides nucléiques lors de l'électrophorèse.
• Couler l'agarose dans le moule avec le peigne et laisser refroidir. Un gel froid et figé prêt à l'emploi se reconnaît par son apparence opalessante quand il est observé par la tranche, comparé à un gel toujours liquide qui est idéalement translucide. Emballé dans du film plastique ou dans du tampon (TÆ, TBE ou SB), le gel peut alors être conservé à 4°C au réfrigérateur pendant plusieurs jours, avant qu'il ne perde trop d'eau par évaporation. La conservation de gels contenant du bromure d'éthidium dans du tampon n'en contenant pas peut conduire à la diffusion du révélateur hors du gel. Ceci peut faire que la distribution du bromure d'éthidium dans le gel soit inhomogène, ce qui finalement peut affecter l'apparence des bandes (les acides nucléiques, de charge négative, migreront plus vite à l'endroit où la concentration du révélateur, de charge positive, sera plus faible).
• Juste avant d'effectuer l'électrophorèse, placer le gel dans la cuve et s'assurer qu'il est recouvert de tampon. Retirer ensuite le peigne, charger les échantillons et les standards, et faire migrer en appliquant une tension ou un courant adaptés. La vitesse de migration des acides nucléiques dépendant du champ électrique, on fixe le plus souvent la tension entre 1 et 5 V par cm (distance entre les électrodes) et on laisser fluctuer le courant (parce que la conductivité du gel fluctue au cours du temps).

Révélation de l'ADN

La méthode révélation la plus utilisée est la révélation au bromure d'éthidium ou BET. Le bromure d'éthidium est un agent d'intercalation fréquemment utilisé comme marqueur d'acide nucléique dans les laboratoires de biologie moléculaire. Quand il est exposé à des rayonnements ultraviolets, il devient fluorescent avec une couleur rouge-orangée, 20 fois plus intense quand il est lié à l'ADN. Cet effet serait dû à l'augmentation de l'hydrophobie de l'environnement, plutôt qu'à une rigidification du cycle benzénique, ce dernier n'étant pas localisé entre les paires de bases.

Alternativement, le gel peut être incubé dans un bain contenant du SYBR Green I (pour les acides nucléiques doubles brins) ou du SYBR Green II (pour détecter aussi les acides nucléiques simples brins). Le SYBR Green présente l'avantage d'une moindre toxicité et d'une sensibilité plus élevée servant à détecter des quantités plus faibles d'acides nucléiques.

Limites de résolution

L'électrophorèse en gel d'agarose permet théoriquement la séparation de fragments d'ADN d'une taille allant de 50 paires de bases à plusieurs millions. Cependant, elle est le plus souvent utilisée pour la séparation de fragment d'une taille allant de 100 pb à 20 kb. La durée moyenne de migration est d'une heure.

Les petits fragments d'acides nucléiques sont mieux scindés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les fragments de tailles importantes sont plus complexes à séparer. Généralement, l'utilisation de gel d'agarose à forte concentration (3 à 4%) est alors indispensable pour des fragments inférieurs à 150 pb, car elle permet une meilleure séparation et résolution des différentes bandes selon leur différence de taille. Le principal désavantage est le temps de migration, qui peut aller jusqu'à plusieurs jours. Pour pallier ces problèmes, il est avantageux d'effectuer une électrophorèse en champ pulsé ou bien une électrophorèse en champ inversé.

Analyse du gel

Après la migration d'électrophorèse, le gel est éclairé sous ultraviolet afin d'observer les bandes d'ADN fluorescente.

Les bandes peuvent être alors découpées et scindées du gel, puis dissoutes pour récupérer l'ADN purifié. L'estimation de la taille des fragments est faite grâce à la comparaison avec l'échelle de marqueur de taille moléculaire (DNA-ladder) utilisée simultanément dans un autre puits lors de la migration.

Le gel est le plus souvent pris en photo avec un appareil photo numérique. Quoique la couleur de l'ADN fluorescent soit rouge-orangée, les photographies sont publiées en noir et blanc (voir schéma ci-dessous).

Les gels d'électrophorèse utilisés en vue de publications sont le plus fréquemment analysés en utilisant des logiciels informatiques, comme par exemple ImageJ.

1	2	3
Un gel d'agarose avant éclairage sous ultraviolets	Le gel est exposé à des rayonnements ultraviolets, le BET colore l'ADN en une couleur rouge-orangée.	Photographie du gel. Puits 1. Echelle de marqueur de poids moléculaire (1kbplus), Puits 2. vide, Puits 3. Un produit de PCR d'une taille un peu supérieure à 500 paires de bases, Puits 4. Fragment d'environ 4.5kb d'un Plasmide digéré par une enzyme de restriction

Références

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