Électrophorèse en gel d'agarose

L'électrophorèse en gel d'agarose est une méthode utilisée en biochimie et en biologie moléculaire pour séparer l'ADN, l'ARN ou des protéines selon leur poids moléculaire.


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Cuve remplie de tampon et transformateur utilisés pour l'électrophorèse en gel d'agarose

L'électrophorèse en gel d'agarose est une méthode utilisée en biochimie et en biologie moléculaire pour séparer l'ADN, l'ARN ou des protéines selon leur poids moléculaire.

La technique de l'électrophorèse en gel d'agarose est basée sur la séparation des acides nucléiques chargés négativement sous l'effet d'un champ électrique. Cette séparation s'effectue à travers la matrice du gel d'agarose : les molécules de plus petites tailles se déplacent plus rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles supérieures[1].

Applications

Les avantages de l'électrophorèse en gel d'agarose sont les suivants :

Facteurs affectant la migration

Le facteur principal est la longueur de la molécule d'ADN : la séparation se fait selon le poids moléculaire et par conséquent de la taille de l'ADN. Cependant la conformation de l'ADN est aussi un facteur important. Ainsi pour éviter les problèmes liés à cette conformation, n'est scindé sur gel d'agarose seulement que de l'ADN linéaire (fragment d'ADN issu d'une digestion, ADN augmenté par PCR ou encore de l'ADNc).

L'augmentation de la concentration d'agarose dans un gel diminué la vitesse de migration et permet la séparation de fragment d'ADN de plus petite taille. Plus le voltage est important, plus la vitesse de migration augmente. Cependant le voltage est limité en intensité, effectivement un fort voltage induit une augmentation de température ce qui peut faire fondre le gel.

La conformation d'ADN plasmidique, non digéré par une enzyme de restriction, migre à différentes vitesses (du plus lent au plus rapide)  : ADN circulaire, ADN linéaire et ADN superenroulé.

Gel d'agarose

On utilise le plus souvent un gel 1% m/v (1 g d'agarose pour 100 ml de volume final) en électrophorèse. Plus on veut un gel discriminant, plus on augmentera le pourcentage d'agarose.

Agarose

L'agarose est un polymère à base d'agar purifié. Différentes puretés d'agarose sont disponibles auprès des fournisseurs. Généralement, de l'agarose de grande pureté à la solidification lente est utilisé quand l'ADN doit être extrait du gel après migration.

Tampons

Il existe un nombre particulièrement varié de tampons. Les plus fréquemment utilisés sont le Tris/Acétate/EDTA (), le Tris/Borate/EDTA (TBE) et le sodium borate (SB).

Le possède le plus faible pouvoir tampon mais produit une meilleure séparation pour les fragments d'ADN de grande taille.
Le SB est assez nouveau et inefficace pour la séparation de fragments d'ADN d'une taille supérieure à 5000 paires de bases (5 kb). Cependant sa faible conductivité permet l'utilisation d'un plus fort voltage (jusqu'à 35V/cm), ceci réduisant énormément le temps de migration.

Des fragments d'ADN avec uniquement quelques paires de bases de différences sont scindés en utilisant un gel d'agarose à 3% et avec un tampon SB de très faible conductivité (1 mM lithium borate). [2]

Préparation

Exemple pour un mini-gel de 50 ml conçu pour séparer des fragments de 2 à 5 kb

Pouvoir de séparation d'ADN linéaire, double brin, selon la concentration d'agarose du gel[3]
Concentration d'agarose (% en M/V) Gamme de tailles parfaites (en kb)
0.3 5 – 60
0.6 1 – 20
0.7 0.8 – 10
0.9 0.5 – 7
1.2 0.4 – 6
1.5 0.2 – 3
2.0 0.1 – 2

Révélation de l'ADN

Gel d'électrophorèse sous UV

La méthode révélation la plus utilisée est la révélation au bromure d'éthidium ou BET. Le bromure d'éthidium est un agent d'intercalation fréquemment utilisé comme marqueur d'acide nucléique dans les laboratoires de biologie moléculaire. Quand il est exposé à des rayonnements ultraviolets, il devient fluorescent avec une couleur rouge-orangée, 20 fois plus intense quand il est lié à l'ADN. Cet effet serait dû à l'augmentation de l'hydrophobie de l'environnement, plutôt qu'à une rigidification du cycle benzénique, ce dernier n'étant pas localisé entre les paires de bases.

Alternativement, le gel peut être incubé dans un bain contenant du SYBR Green I (pour les acides nucléiques doubles brins) ou du SYBR Green II (pour détecter aussi les acides nucléiques simples brins). Le SYBR Green présente l'avantage d'une moindre toxicité et d'une sensibilité plus élevée servant à détecter des quantités plus faibles d'acides nucléiques.

Limites de résolution

L'électrophorèse en gel d'agarose permet théoriquement la séparation de fragments d'ADN d'une taille allant de 50 paires de bases à plusieurs millions. Cependant, elle est le plus souvent utilisée pour la séparation de fragment d'une taille allant de 100 pb à 20 kb. La durée moyenne de migration est d'une heure.

Les petits fragments d'acides nucléiques sont mieux scindés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les fragments de tailles importantes sont plus complexes à séparer. Généralement, l'utilisation de gel d'agarose à forte concentration (3 à 4%) est alors indispensable pour des fragments inférieurs à 150 pb, car elle permet une meilleure séparation et résolution des différentes bandes selon leur différence de taille. Le principal désavantage est le temps de migration, qui peut aller jusqu'à plusieurs jours. Pour pallier ces problèmes, il est avantageux d'effectuer une électrophorèse en champ pulsé ou bien une électrophorèse en champ inversé.

Analyse du gel

Après la migration d'électrophorèse, le gel est éclairé sous ultraviolet afin d'observer les bandes d'ADN fluorescente.

Les bandes peuvent être alors découpées et scindées du gel, puis dissoutes pour récupérer l'ADN purifié. L'estimation de la taille des fragments est faite grâce à la comparaison avec l'échelle de marqueur de taille moléculaire (DNA-ladder) utilisée simultanément dans un autre puits lors de la migration.

Le gel est le plus souvent pris en photo avec un appareil photo numérique. Quoique la couleur de l'ADN fluorescent soit rouge-orangée, les photographies sont publiées en noir et blanc (voir schéma ci-dessous).

Les gels d'électrophorèse utilisés en vue de publications sont le plus fréquemment analysés en utilisant des logiciels informatiques, comme par exemple ImageJ.

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Un gel d'agarose avant éclairage sous ultraviolets
Le gel est exposé à des rayonnements ultraviolets, le BET colore l'ADN en une couleur rouge-orangée.
Photographie du gel. Puits 1. Echelle de marqueur de poids moléculaire (1kbplus), Puits 2. vide, Puits 3. Un produit de PCR d'une taille un peu supérieure à 500 paires de bases, Puits 4. Fragment d'environ 4.5kb d'un Plasmide digéré par une enzyme de restriction

Références

  1. Sambrook J, Russel DW (2001). Molecular Cloning : A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY.
  2. Brody JR, Calhoun ES, Gallmeier E, Creavalle TD, Kern SE (2004). Ultra-fast high-resolution agarose electrophoresis of DNA and RNA using low-molarity conductive media. Biotechniques. 37 :598-602. [1]
  3. Sambrook J, Russel DW (2001). Molecular Cloning : A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY.


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