Chromatographie en phase liquide à haute performance / HPLC / Chromatographie en phase liquide à haute pression

La chromatographie en phase liquide à haute performance — CLHP, mais on trouve plus souvent l'abréviation anglaise HPLC depuis les années 1990 — est une technique de séparation analytique selon l'hydrophobicité...


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Chromatographie - Chimie analytique

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La chromatographie en phase liquide à haute performanceCLHP, mais on trouve plus souvent l'abréviation anglaise HPLC (high performance liquid chromatography) depuis les années 1990 — est une technique de séparation analytique selon l'hydrophobicité et préparative des molécules d'un composé ou un mélange de composés. Pour certains, HP veut dire «haute pression».

Cette forme de chromatographie est souvent utilisée en biochimie, ainsi qu'en chimie analytique.

Principe

L'échantillon à analyser est poussé par un liquide (appelée phase mobile) dans une colonne remplie d'une phase stationnaire de fine granulométrie (les "grains" sont de très petite taille). Le débit d'écoulement de la phase mobile est élevé ce qui entraîne une augmentation de la pression dans le dispositif. Ce débit élevé diminue le temps indispensable pour séparer les composants le long de la phase stationnaire. La fine granulométrie de la phase stationnaire permet une meilleure séparation des composants. En effet, pour un même volume de phase stationnaire la surface d'échange augmente si les "grains" qui la composent sont de diamètre plus petit. Les pics obtenus sont plus étroits par conséquent la résolution est perfectionnée (les pics sont bien scindés, on peut par conséquent bien les différencier), le seuil de détection est aussi plus bas (des pics étroits et hauts sont plus faciles à isoler du bruit de fond que des pics larges et bas). La combinaison de ces attributs - rapidité et résolution élevées - conduit à l'appellation «haute performance».
Les solvants utilisés sont des combinaisons miscibles d'eau et de divers liquides organiques (alcools, acétonitrile, dichlorométhane, ... ).
Fréquemment, la composition de la phase mobile est modifiée au cours de l'analyse, c'est le mode dit "gradient" ou "élution graduée" (en opposition au mode "isocratique", pour lequel la composition de la phase mobile reste la même tout au long de l'analyse). A titre d'exemple, sur une colonne apolaire, en utilisant un mélange eau/méthanol comme phase mobile, les composants les plus hydrophobes sont élués avec une concentration élevée en méthanol tandis que les composants plus hydrophiles sont élués préférentiellement avec une concentration faible en méthanol. Selon la nature de la phase stationnaire, on commencera par une concentration élevée en méthanol ou le contraire.

Appareillage et fonctionnement

La pompe

C'est la partie qui permet de stocker l'éluant ainsi qu'à l'injecter sous pression dans la colonne. Elle se compose de :

On utilise une pompe pour une élution isocratique ou plusieurs pour une élution par gradient.

L'injecteur

Des tubes en acier inoxydable, en Teflon, en PEEK ou en silice fondue permettent de relier l'ou les pompes à l'injecteur chromatographique. Il y a plusieurs types d'injecteurs :

La colonne

Elle dépend du type de chromatographie en phase liquide qu'on veut faire et par conséquent de la nature et du nombre de composés qu'on veut séparer. Il peut y avoir plusieurs colonnes parallèles. Il y a par conséquent plusieurs types de chromatographies en phase liquide :

La chromatographie d'adsorption

Article détaillé : Chromatographie d'adsorption.

Dans cette chromatographie, la phase stationnaire consiste en une matière solide à grand pouvoir d'adsorption, tel que l'oxyde d'aluminium, les silicates de magnésium, les gels de silice. Les composants sont simplement plus ou moins retenus à la surface de la phase stationnaire par adsorption physique. C'est une technique qui prend en compte la polarité des composants.

La chromatographie de partage

Article détaillé : Chromatographie de partage.

Dans cette chromatographie les analytes sont scindés selon leur affinité avec les phases stationnaire et mobile. L'affinité dépend de la polarité des analytes et des phases. En mode normal la phase stationnaire est polaire, en mode inverse elle est apolaire. Il y a deux types de chromatographie de partage :

La chromatographie par échange d'ions

Article détaillé : Chromatographie à échange d'ions.

La phase solide est une résine insoluble pourvue de groupes fonctionnels capable de dissocier. Ce sont , généralement, des groupes "acide sulfonique" (SO3H) pour les échangeurs de cations et "ammonium quaternaire" (N (R) 3) pour les échangeurs d'anions.

La chromatographie d'exclusion stérique

Les composants sont scindés selon leur dimension moléculaire. La phase stationnaire se compose d'un matériau poreux (petites particules de silice ou de polymères), les molécules dont le diamètre est supérieur à celui des pores ne peuvent pénétrer et ne sont pas retenues. La durée de séjour dans la colonne augmente quand la taille des analytes diminue.

La chromatographie chirale

Article détaillé : Chromatographie chirale.

Cette technique de chromatographie consiste en la formation de liaisons non covalentes entre les énantiomères du substrat et l'absorbant chromatographique chiral donnant des complexes diastéréoisomères ayant des affinités de liaisons différentes. Elle sert par conséquent surtout à séparer des énantiomères.

Le détecteur

Il existe plusieurs types de détecteurs :

Les différentes phases stationnaires

Phase normale

Les colonnes en phase normale sont des colonnes dont la phase stationnaire est polaire et acide.

La phase normale la plus utilisée est à base de gel de silice : à sa surface se trouvent des groupes silanols (-OH) et des groupes siloxanes (-O-). Ces groupes autorisent la silice de retenir les composés à analyser par des liaisons hydrogènes.

Cette phase sert ainsi essentiellement à séparer des composés polaires.

Phase inverse

La base d'une phase inverse est une phase normale sur laquelle des chaînes alkyles (ou autres selon la polarité recherchée) ont été greffées au niveau des groupes silanols (end-capping). Généralement, la phase stationnaire est surtout composée de petites particules de silice sur lesquels on a greffé des fonctions chimiques, le plus fréquemment de chaines alkyles à 8 ou 18 atomes de carbones.
Les fonctions silanols (Si-OH) qui subsistent génèrent des interactions hydrophiles parasites, qui rendent les résultats non reproductibles en particulier pour les molécules basiques. Pour éviter cela, la surface de la silice est le plus souvent recouverte par une fonction méthyle et les fonctions silanols ne sont plus libres mais sous la forme (Si-O-CH3), c'est cette étape qu'on nomme "end-capping". Les fonctions chimiques utilisées pour le "end-capping" peuvent cependant être de nature particulièrement diverses et les colonnes de dernières générations résistant à des pH extrêmes sont le plus souvent "end-capped" avec des fonctions proposant une plus grande gène stérique, tel que le tert-butyle (Si-O-C (CH3) 3).

Selon le taux de greffage, on obtient une plus ou moins grande résolution.

Cette phase stationnaire est dite "inverse" car de polaire et hydrophile (sans les "greffes"), la phase devient apolaire et hydrophobe.

Paramètres de chromatographie

La qualité et la durée d'une séparation peuvent changer avec la nature de la phase stationnaire et de la phase mobile utilisées. Mais pour un même type de phase stationnaire et une même phase mobile, la qualité et la durée d'une séparation peuvent aussi être modifiées par les caractéristiques géométriques et opératoires de ces deux phases.

Caractéristiques géométriques de la phase stationnaire

Caractéristiques opératoires de la phase mobile

\Delta P = \Phi \cdot \frac{\eta \cdot L \cdot u}{{d_p}ˆ2}
η est la viscosité de la phase mobile et Φ est le facteur de résistance à l'écoulement qui dépend de la forme des particules et de la qualité du remplissage de la phase stationnaire.
Pour des colonnes bien remplies de particules sphériques ou irrégulières, la formule empirique suivante, établie avec les unités usuelles, permet le calcul commode d'une estimation de ΔP selon le débit F de la phase mobile avec une incertitude inférieure à 25%

\Delta P (MPa) = 400 \cdot \frac{F (ml/min) \cdot L (cm) \cdot \eta (cP)} {{d_p (\mu m)}ˆ2 \cdot {d_c (mm)}ˆ2}

Remarque : la loi de Darcy est à l'hydraulique ce que la loi d'Ohm est à l'électricité. La pression hydraulique est analogue au potentiel électrique, le débit de liquide est analogue à l'intensité du courant, la perméabilité hydraulique est analogue à la conductivité électrique, la pressurisation et la dépressurisation d'une colonne chromatographique sont respectivement analogues à la charge ainsi qu'à la décharge d'un condensateur électrique.

Grandeurs caractéristiques en chromatographie

Le résultat observable d'une analyse HPLC se présente sous la forme d'une courbe du signal détecté selon le temps : c'est le chromatogramme. Il comporte plusieurs pics de forme gaussienne, de caractéristiques différentes :


De là peuvent être calculées plusieurs caractéristiques de la colonne pour la séparation des pics :

k' = \frac{t_R - t_0}{t_0}

N = 16 \cdot \frac{t_Rˆ{2}}{wˆ{2}} = 5,54 \cdot \frac{t_Rˆ{2}}{w_{1/2}ˆ{2}}
Cette valeur mesure la finesse du pic. À partir de cette valeur peut être calculée la hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT) H, qui sert à comparer des colonnes de longueur différente
H = \frac{L}{N}

\alpha = \frac{k'_2}{k'_1}
Elle mesure la capacité de la colonne à séparer les maxima des pics. Plus elle est supérieure à 1, plus les temps de rétention sont éloignés.

R_S = 2 \cdot \frac{t_{R2} - t_{R1}} {w_{1} + w_{2}}
Cette valeur mesure la qualité de séparation et d'absence de recouvrement entre les 2 pics reconnus.


La résolution ainsi définie est l'objectif de la séparation chromatographique. C'est une fonction des trois caractéristiques (efficacité, sélectivité et rétention), elles-mêmes définies ci-dessus, dont l'expression est
R_{S1,2} = \frac1 4\cdot\sqrt{N}\cdot\frac{\alpha-1} {\alpha}\cdot\frac{k'_2} {1+k'_2}

Cette expression montre surtout qu'une même résolution peut être obtenue dans des conditions chromatographiques ou bien particulièrement efficaces (optimisation cinétique) ou bien particulièrement sélectives (optimisation thermodynamique). Quoi qu'il en soit, la performance qui caractérise la technique HPLC est définie par le pouvoir de résolution par unité de temps, ce qui n'implique pas toujours l'utilisation de la pression la plus haute envisageable.


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