Denaturing High Performance Liquid Chromatography

La Denaturing High Performance Liquid Chromatography est une méthode chromatographique donnant la possibilité de la détection de substitutions de bases, de petites délétions ou d'insertions au niveau de l'ADN.


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Chromatographie - Chimie analytique

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La Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC) est une méthode chromatographique donnant la possibilité de la détection de substitutions de bases, de petites délétions ou d'insertions au niveau de l'ADN. Grâce à sa rapidité et sa résolution élevées, cette méthode est spécifiquement utile pour la recherche de polymorphismes dans l'ADN.

En pratique, l'analyse débute par une PCR classique afin d'augmenter le fragment étudié. Si la région augmentée présente un polymorphisme hémizygote, deux types de fragments, correspondant à l'allèle sauvage ainsi qu'à l'allèle polymorphe, seront présents dans le produit de PCR. Cette première étape est suivie d'une étape de dénaturation - renaturation pour créer des hétéro- et homoduplexes à partir des deux populations présentes dans la PCR. Pour rechercher un polymorphisme homozygote, il faut procéder de la même manière en mélangeant au préalable une population d'ADN sauvage à une population d'ADN polymorphe pour obtenir des hétéroduplexes après l'étape de dénaturation - renaturation.

Les hétéroduplexes sont en fait des doubles brins d'ADN constitués d'un brin venant de l'allèle sauvage et d'un brin issu de l'allèle polymorphe. La formation de tels fragments d'ADN entraîne alors la naissance d'un «mismatch» ou mauvais appariement à l'endroit où est situé le polymorphisme.


Ces «mismatches» présents au niveau des hétéroduplexes sont à la base de la détection de polymorphismes par la DHPLC. En effet, les hétéroduplexes, thermiquement moins stables que leurs homoduplexes correspondants, seront résolus grâce à la chromatographie quand ils seront soumis à une température suffisamment élevée. La conséquence de cette instabilité sera un désappariement des deux brins d'ADN dans la région du polymorphisme quand l'ADN sera chauffé à température correcte. Ce désappariement entraînera par conséquent une diminution de l'interaction avec la colonne et par conséquent un temps de rétention réduit comparé aux homoduplexes lors de la séparation chromatographique.

Pour observer ce phénomène de séparation, la DHPLC utilise une colonne greffée d'une phase stationnaire non poreuse composée de poly (styrène-divinylbenzène) alkylé. Cette phase stationnaire est électriquement neutre et hydrophobe. L'ADN, lui, est chargé négativement au niveau de ses groupements phosphates et ne peut par conséquent s'adsorber de lui-même au niveau de la colonne. Pour rendre l'adsorption envisageable, on utilise de l'acétate de triéthylammonium (TEAA). Les ions ammonium chargés positivement de ces molécules interagissent avec l'ADN et les chaînes alkyl, avec la surface hydrophobe de la phase solide.

Ainsi, quand les hétéroduplexes sont partiellement dénaturés par chauffage, des charges négatives subissent une délocalisation partielle et la force d'interaction entre l'ADN des hétéroduplexes et la colonne diminue en comparaison à la force d'interaction des homoduplexes. Ces derniers seront alors élués moins rapidement par la phase mobile, composée d'acétonitrile, comparé aux hétéroduplexes qui passeront alors les premiers devant le détecteur UV (Ultraviolet) .


Voir aussi

HPLC

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