Microscope optique

Le microscope optique est un instrument d'optique pourvu d'un objectif et d'un oculaire qui sert à grossir l'image d'un objet de petites dimensions et de séparer les détails de cette image afin qu'il soit observable par l'œil humain.

Catégories :

Microscope optique

Un microscope optique de base.

Le microscope optique est un instrument d'optique pourvu d'un objectif et d'un oculaire qui sert à grossir l'image d'un objet de petites dimensions (ce qui caractérise son grossissement) et de séparer les détails de cette image (et son pouvoir de résolution) afin qu'il soit observable par l'œil humain. Il est utilisé en biologie, pour observer les cellules, les tissus, en pétrographie pour reconnaître les roches, en métallurgie et en métallographie pour examiner la structure d'un métal ou d'un alliage.

Il ne faut pas le confondre avec la loupe binoculaire qui n'exige pas des échantillons plats de faible épaisseur, ou réfléchissants, et permet d'observer des pièces naturelles sans préparation en grossissant l'image d'un facteur peu élevé, mais en gardant une vision stéréoscopique propice à l'examen macroscopique révélateur de grains, de criques, de fissures, etc.

Histoire

Il est complexe de dire qui a découvert le microscope composé. On dit fréquemment que l'opticien hollandais Hans Janssen et son fils Zacharias Janssen fabriquèrent le premier microscope en 1590, mais ceci provient d'une déclaration de Zacharias Janssen lui-même au milieu du XVII^e siècle. La date annoncée est assez improbable étant donné qu'il a été montré que Zacharias Janssen est né vers 1590.

Un autre favori au titre d'inventeur du microscope est Galilée. Il a développé un occhiolino, un microscope composé d'une lentille convexe et d'une autre concave en 1609.

Un dessin par Francesco Stelluti de trois abeilles figure sur le sceau du pape Urbain VIII (1623-1644) et passe pour la première image de microscopie publiée^[1]. Christian Huygens, un autre Hollandais, a développé à la fin du XVII^e siècle un oculaire simple à deux lentilles corrigé des aberrations chromatiques, ce qui fut un grand pas en avant dans le développement du microscope. L'oculaire de Huygens est toujours fabriqué actuellement, mais souffre d'un champ assez réduit et d'autres problèmes mineurs.

On attribue généralement à Antoni van Leeuwenhœk (1632-1723) le fait d'avoir attiré l'attention des biologistes sur les utilisations du microscope, même si des loupes ordinaires étaient déjà fabriquées et utilisées au XVI^e siècle. Les microscopes artisanaux de Van Leeuwenhœk étaient des instruments simples et de taille réduite comprenant une lentille unique mais forte. En comparaison, les dispositifs à plusieurs lentilles restaient complexes à mettre au point et il fallut pas moins de 150 ans de développement des optiques avant que le microscope composé puisse livrer une qualité d'image équivalente à celle des microscopes simples de Van Leeuwenhœk. Néanmoins, et malgré de nombreuses revendications, on ne peut pas considérer Van Leeunwenhœk comme l'inventeur du microscope composé.

Microscope optique (1751)

Microscope de Cuff (1760)

Microscope Zeiss, Jena (1879)

Modèle Voigt & Hochgesang" (1890)

Première approche

Principe du microscope optique de base

Principe d'un microscope simplifié.

Le microscope optique se base sur les lentilles pour obtenir une image agrandie de l'échantillon à observer.

L'objet à observer est positionné devant la première lentille nommée «objectif». Si l'objet est au-delà de la distance focale, cela forme une image réelle inversée et de taille différente ; l'image est plus grande que l'objet si ce dernier est localisé à une distance inférieure au double de la distance focale de l'objectif.

La seconde lentille est l'oculaire : elle est située de sorte que l'image soit dans son plan focal. Ainsi, l'œil observe une image «à l'infini», par conséquent en relâchant les muscles chargés de l'accommodation, ce qui représente un meilleur confort visuel.

Il s'agit d'un dispositif centré dioptrique, composé en partie de doublets pour en corriger certaines des aberrations optiques.

A contrario d'autres dispositifs optiques qui sont définis par leur grossissement optique (télescope) ou leur grandissement (appareil photographique), le terme approprié, pour le microscope, est sa puissance, rapport de l'angle, sous lequel est vu l'objet à travers l'instrument, à la longueur de cet objet.

La technique d'illumination la plus utilisée en microscopie à champ large classique est l'illumination de Köhler, qui garantit une qualité d'image optimale.

Constitution du microscope

Schéma d'un microscope optique.

De bas en haut :

miroir : permet de réfléchir la lumière ambiante pour éclairer l'échantillon par en dessous, dans le cas d'un échantillon transparent (par exemple une lame mince en biologie ou en géologie, ou un liquide) ;
source de lumière artificielle de meilleure température de couleur et de stabilité et par l'usage d'un condenseur autorise cette lumière de remplir d'une façon homogène et régulière le champ observé, et en particulier de ne pas faire voir, par son réglage correct, les détails mécaniques de la source de lumière (spires du filament de l'ampoule). La source d'éclairage peut être plus élaborée et comporter un boîtier indépendant, peut-être en lumière polarisée ou ultraviolet, pour faire ressortir certaines propriétés chimiques de la matière, ou éclairer l'échantillon par-dessus (surtout en métallurgie)
diaphragme : ouverture de diamètre variable servant à restreindre la quantité de lumière qui éclaire l'échantillon. Comme pour un appareil photo, le diaphragme permet essentiellement de faire fluctuer la profondeur de champ (ouvert à fond pour des coupe histologiques et plus fermé pour des recherches d'œufs de parasites digestifs) ;
platine porte-échantillon : où on pose l'échantillon ; les pinces servent à tenir l'échantillon quand ce dernier est mince (par exemple une lame de verre). La platine peut être mobile (gauche-droite et avant-arrière), ce qui sert à balayer l'échantillon et de sélectionner la partie observée ;
objectifs : lentille ou ensemble de lentilles réalisant le grossissement. Il y a généralement plusieurs objectifs, correspondant à plusieurs grossissements, montés sur un barillet. Certains objectifs sont dits à immersion car leur puissance ne peut être atteinte qu'en éliminant la lame d'air entre l'échantillon couvert par la lamelle et la frontale de l'objectif. On utilise pour cela de l'huile de cèdre ou des huiles de synthèse dont l'indice de réfraction est proche de celui du verre.
mise au point grossière et fine ; pour que l'image soit nette, il faut que l'objet soit dans le plan focal de l'objectif ; ces molettes font monter et descendre la totalité objectif-oculaire avec un dispositif de crémaillère, afin d'amener le plan focal sur la zone de l'échantillon à observer ;
oculaire : lentille ou ensemble de lentilles formant l'image d'une manière reposante pour l'œil ; les rayons arrivent parallèles, comme s'ils venaient de très loin, ce qui permet un relâchement des muscles contrôlant le cristallin ; deux oculaires positionnés sur une tête dite binoculaire rend plus confortable l'observation (même si elle n'apporte pas de vision stéréoscopique).

L'oculaire peut être remplacé par un appareil photographique, ou - dans le cas de la vidéomicroscopie - par une caméra vidéo ou une caméra CCD pour faire une acquisition numérique. Ceci sert à faire l'observation sur un moniteur vidéo (écran de type télévision) et de favoriser l'utilisation et le traitement des images (impression, traitement informatique, télémédecine, etc. ).

Limites du microscope optique

La résolution d'un microscope sert à désigner sa capacité à séparer des détails particulièrement voisins. Indépendamment du capteur utilisé et des aberrations ou imperfections des lentilles, la résolution du microscope optique est principalement limitée par la diffraction de la lumière. En effet, du fait de la diffraction, l'image d'un point n'est pas un point, mais une tache (la tache d'Airy ou d'une façon plus générale la fonction d'étalement du point - PSF). Ainsi, deux points différents mais voisins auront pour images deux taches dont le recouvrement peut empêcher de distinguer les deux points images : les détails ne sont alors plus résolus.

Selon la théorie d'Abbe, la limite de résolution (transverse) $d$ d'un microscope, c'est-à-dire la plus petite distance en dessous de laquelle deux points voisins ne seront plus distingués, peut être exprimée simplement avec la longueur d'onde d'illumination $λ$ , de l'indice de réfraction $n$ en sortie d'objectif, et du demi angle du cône de lumière maximum accessible $α$ .

$d=\frac{\lambda}{2\,n\,\sin\alpha}=\frac{\lambda}{2\,\textrm{NA}}$

où NA sert à désigner le produit $n sinα$ ou ouverture numérique de l'objectif. On peut par conséquent augmenter la résolution de deux manières :

En augmentant l'indice de réfraction. Ceci peut être réalisé en utilisant un objectif à immersion : on immerge la frontale de l'objectif dans un liquide dont l'indice de réfraction est proche du maximum de 1, 5 - celui du verre.
En diminuant la longueur d'onde. Cependant, si on reste dans la lumière visible, il n'est pas envisageable de descendre en dessous de 400 nm.

La limite de résolution d'un microscope photonique classique est d'environ 0, 2 μm. Le microscope électronique en transmission atteindra, lui, une limite 100 fois plus petite.

Des techniques de microscopie photonique permettent de dépasser la limite d'Abbe. Elles sont quelquefois dites "super résolution" ou nanoscopies. Voici entre autres :

les techniques d'illumination structurée et les techniques tomographiques qui cherchent à récupérer les hautes fréquences spatiales coupées dans un microscope classique.
les techniques utilisant les ondes évanescentes (SNOM).
les techniques utilisant une mise en forme de la réponse impulsionnelle optique (PSF) : microscopie confocale, microscopie STED.
les techniques utilisant la localisation successive de molécules individuelles, photoactivation localisation microscopy (PALM, Betzig et al., 2006) et stochastic optical reconstruction microscopy (STORM, Rust et al., 2006).

Utilisations et perfectionnement du microscope optique

Microscopie en réflexion

Lorsque on utilise un microscope classique, on l'utilise en transmission, c'est-à-dire que la lumière traverse l'échantillon observé. Il est aussi envisageable de travailler «en réflexion». Dans ce cas, l'échantillon est illuminé du même côté que l'observateur, soit par le dessus pour un microscope droit et par le dessous dans le cas des microscopes inversés utilisés en métallographie ou en cristallographie. La lumière produite par la source passe une première fois par l'objectif, arrive sur l'échantillon, est réfléchie et repasse par l'objectif pour observation ce qui nécessite plusieurs jeux de miroirs ou prismes.

La microscopie en réflexion permet d'examiner des objets opaques, ou trop épais pour la transmission. En contrepartie évidemment, elle ne peut donner que des informations sur la surface de l'échantillon dans le cas de l'observation en lumière blanche ; en lumière polarisée, elle sert à révéler les orientations de grains des constituants des minéraux ou métaux.

Un cas classique est la métallographie où on réalise des observations de pièces de métal nommées micrographies de cette manière. Comme dit plus haut le microscope est fréquemment inversé, la pièce à observer positionnée posée sur la plaque support (en général percée d'un trou circulaire).

L'éclairage épiscopique

A contrario des éclairage diascopiques (dia - à travers), l'éclairage épiscopique (épi - autour) permet d'observer des objets opaques en couleur et en leur donnant un rendu plus «naturel».

L'idée d'un tel éclairage est ancienne, puisqu'en 1740, Descartes a inspiré Lieberkühm qui a créé pour ses observations au microscope un miroir en argent entourant l'objectif, le foyer de ce miroir ciblant la préparation.

Microscopie en champ clair

La microscopie optique en champ clair (ou «à fond clair») est la plus simple et la plus ancienne des techniques de microscopie. Les longueurs d'onde utilisées (spectre visible) limitent le pouvoir séparateur de ce microscope à 0, 2 µm pour ceux d'entre eux qui ont les meilleures optiques.
L'illumination se fait par transmission de lumière blanche, c'est-à-dire que l'échantillon est illuminé par dessous et observé par dessus. Les limitations de cette technique sont essentiellement un faible contraste de la majorité des échantillons biologiques et une résolution faible due au flou créé par la matière hors du plan focal. En contrepartie, la technique est simple et l'échantillon ne nécessite qu'une préparation minime.

Si l'échantillon est éclairé par dessus, le microscope est dit «microscope inversé» ; L'objectif est alors localisé en dessous de la préparation, et le tube porte oculaire redresse les faisceaux de lumière pour que les oculaires soient "normalement" situés pour l'utilisateur.

Microscopie en champ sombre

Le microscope à fond noir qui utilise le principe de la «microscopie en champ sombre» permet de perfectionner le contraste d'échantillons transparents mais non teintés ^[2].
L'illumination de champ sombre utilise une source de lumière alignée avec soin pour minimiser la quantité de lumière directement transmise et de ne collecter que la lumière diffusée par l'échantillon. Elle permet d'augmenter énormément le contraste, en particulier pour les échantillons transparents, tout en ne nécessitant que peu d'équipement et une préparation d'échantillon simple. Cependant, cette technique souffre d'une faible intensité lumineuse collectée et est toujours affectée par la limite de résolution.

L'illumination de Rheinberg est une variante de l'illumination en champ sombre dans laquelle des filtres transparents de couleur sont insérés juste avant le condenseur, de sorte que les rayons lumineux plus ou moins obliques soient colorés différemment (le fond de l'image peut être bleu alors que l'échantillon apparaît jaune brillant). La limite de résolution est la même que celle en champ sombre. D'autres combinaisons de couleurs sont envisageables, mais leur efficacité est assez variable^[3].

La microscopie à fond noir est spécifiquement adaptée aux échantillons frais et autorise la microcinématographie (par exemple de bactéries en déplacement). Elle n'a pas d'intérêt pour les objets colorés (frottis ou coupes colorés). Elle est surtout utile pour :

observer des êtres ou objets plats à structure régulière et transparents tels que diatomées, radiolaires...
observer des formations filiformes (ex : flagelles, fibres, bactéries, certains cristaux... )
observer des objets punctiformes ou linéaires particulièrement fins, dont la taille serait limite pour la séparation du microscope à fond clair. Ces objets donneront une image de points ou traits particulièrement lumineux, (Exemple : Treponema pallidum, agent de la syphilis) ainsi qu'aux contours nets si l'objet est suffisamment épais, ou borrelia agent de la maladie de Lyme, pour les bactéries les plus grandes)

Illumination oblique

L'utilisation d'une illumination oblique (par le côté) donne une image d'apparence tridimensionnelle et peut valoriser des aspects invisibles autrement. C'est le principal avantage. Les limitations sont les mêmes que celles de la microscopie en champ clair.

Microscopie en lumière polarisée

Article détaillé : Microscopie en lumière polarisée.

En microscopie en lumière polarisée, on place l'échantillon entre un polariseur et un analyseur pour détecter les variations de polarisation de la lumière après la traversée de l'échantillon. Cette technique est particulièrement utile pour l'observation des milieux biréfringents, surtout en minéralogie.

Microscopie en fluorescence

Article détaillé : Microscopie à fluorescence.

Lorsque certains composés sont illuminés par une source de lumière de haute énergie, ils émettent alors de la lumière à une énergie plus basse. C'est le phénomène de fluorescence. La microscopie à fluorescence consiste à former une image en collectant cette lumière émise.

Cette méthode est actuellement de première importance dans les sciences de la vie. Elle peut être particulièrement sensible, autorisant même la détection de molécules isolées. On utilise plusieurs teintures fluorescentes pour marquer différentes structures ou composés chimiques. Ceci sert à détecter simultanément des composés différents, tout en les différenciant par leur couleur de fluorescence.

Le microscope à contraste de phase

Article détaillé : Microscope à contraste de phase.

Le contraste de phase est une technique beaucoup utilisée qui sert à valoriser les différences d'indices de réfraction comme différence de contraste. Elle a été développée par le physicien hollandais Frederik Zernike dans les années 1930 (il reçut pour cela le prix Nobel en 1953). Le noyau d'une cellule par exemple apparaîtra sombre dans le cytoplasme environnant. Le contraste est excellent, néanmoins cette technique ne est parfois utilisée avec les objets épais. Fréquemment, un halo se forme autour des petits objets qui peut noyer des détails.

Le dispositif consiste en un anneau circulaire dans le condenseur qui produit un cône de lumière. Ce cône est juxtaposé à un anneau de taille identique dans l'objectif. Chaque objectif a un anneau de taille différente, aussi il est indispensable d'adapter le condenseur à chaque changement d'objectif. L'anneau dans l'objectif a des propriétés optiques spéciales : il diminué l'intensité de la lumière directe et , ce qui est plus important, il crée une différence de phase artificielle d'un quart de longueur d'onde qui crée des interférences avec la lumière diffusée, et qui crée le contraste de l'image.

Le microscope confocal

Article détaillé : Microscope confocal.

Le microscope confocal génère une image d'une manière complètement différente de la microscopie normale en champ clair. La résolution est un peu meilleure, mais le point principal est qu'il sert à former une image de coupes transversales sans être perturbé par la lumière hors du plan focal. Il donne par conséquent une image particulièrement nette des objets en trois dimensions. Le microscope confocal est fréquemment utilisé en conjonction avec la microscopie à fluorescence.

Le microscope à statif inversé

Article détaillé : Microscope à statif inversé.

Préparation des échantillons

L'échantillon observé doit remplir certaines conditions :

de planéité, pour que l'objectif en donne une image entière nette, faute de quoi on ne peut en observer qu'une portion restreinte
en transmission, il doit être de faible épaisseur pour que la lumière le traverse et ne rende visible que quelques éléments (cellules) dans le cas de la biologie ;
en réflexion, la surface doit être généralement polie pour que les rayures ne masquent pas ce qu'on veut observer ;
les parties à observer doivent pouvoir se différencier :
- différenciation de couleurs par la coloration chimique de solutions standardisées, pour la biologie ;
- attaque chimiques par des acides pour révéler des défauts en métallurgie ;
- d'autres différenciations par l'éclairage en lumière polarisée, en ultra-violet (fluorescence), ou par principe interférentiel, révélant d'autres aspect, invisibles à l'œil nu.

En biologie, il est indispensable, au préalable, de placer la coupe de tissu (ou le liquide contenant des organismes vivants) entre une lame et une lamelle de verre. L'objectif doit s'approcher de la lame pour la mise au point sans, par maladresse, détruire la préparation devenue particulièrement fragile.

Du fait de la préparation, la microscopie optique nécessite une importante quantité d'appareils complémentaires pour l'unique destination de l'observation microscopique.

Prenons le cas de la biopsie en médecine et biologie (anatomopathologie) : le diagnostic par microscopie, de pièces biologiques prélévées par biopsie pendant une opération, impose des délais courts. Pour préparer la lame, on utilise un appareil nommé cryotome, une sorte de «trancheuse à jambon», positionnée dans un cryostat (congélateur), qui sert à découper des tranches particulièrement fines du corps qui sera à observer en le refroidissant rapidement, puis en le découpant avec la lame d'un rasoir spécial, affûté sur une autre machine à plaque de verre avec pâtes diamantées. Si on veut travailler à température ambiante, les délais sont plus longs et imposent des déshydratations et remplacement des eaux supprimées par de la paraffine (24 heures) pour que l'échantillon garde sa rigidité ; ensuite, il est coloré par plusieurs substances d'actions alternées de durée particulièrement longues, elles aussi.

Notes et références

Stephen Jay Gould, The Lying stones of Marrakech, (les pierres truquées de Marrakech en français), 2000.
Abramowitz M, Davidson MW, «Darkfield Illumination», 2007. Consulté le 2007-08-22
Abramowitz M, Davidson MW, «Rheinberg Illumination», 2007. Consulté le 2007-08-22

(en) Cet article est partiellement ou en totalité issu de l'article de Wikipédia en anglais intitulé «Microscopy» (voir la liste des auteurs)

(en) Cet article est partiellement ou en totalité issu de l'article de Wikipédia en anglais intitulé «Optical microscope» (voir la liste des auteurs)

Voir aussi

Liens externes

(fr) Principes et utilisations de base du microscope, cours en ligne.
(fr) CFM, le Club Français de Microscopie (en français)
(fr) "www. microscopies. com" site internet sur la microscopie
(fr) "www. microscopie. ch" site amateur (membre lenaturaliste. net) de microphotographie
(fr) Histoire du microscope et de la microscopie
(fr) (en) (de) (nl) "www. microscopie. be" Société royale anversoise de micrographie
(en) site internet de photos prises au microscope
(en) Une collection de microscopes antiques
(de) Une collection de microscopes antiques fabriqués en France et en Allemagne 1820 - 1950 avec d'avantage de 2500 photos

Recherche sur Google Images :

"et le microscope optique"
L'image ci-contre est extraite du site techno-science.net

Il est possible que cette image soit réduite par rapport à l'originale. Elle est peut-être protégée par des droits d'auteur.

Voir l'image en taille réelle (300 × 262 - 29 ko - png)

Refaire la recherche sur Google Images

Recherche sur Amazone (livres) :

Principaux mots-clés de cette page : microscope - échantillons - lumière - microscopie - image - objectif - optique - objet - observer - technique - champ - lentille - illumination - résolution - point - oculaire - sert - particulièrement - contraste - préparation - composé - observation - limites - lame - utilise - fluorescence - biologie - simple - dessous - source -

Ce texte est issu de l'encyclopédie Wikipedia. Vous pouvez consulter sa version originale dans cette encyclopédie à l'adresse http://fr.wikipedia.org/wiki/Microscope_optique.
Voir la liste des contributeurs.
La version présentée ici à été extraite depuis cette source le 30/11/2010.
Ce texte est disponible sous les termes de la licence de documentation libre GNU (GFDL).
La liste des définitions proposées en tête de page est une sélection parmi les résultats obtenus à l'aide de la commande "define:" de Google.
Cette page fait partie du projet Wikibis.