Microscope de fluorescence par réflexion totale interne

Le microscope de fluorescence par réflexion totale interne, ou TIRFM pour Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy, est un type spécifique de microscope optique à fluorescence permettant d'examiner une tranche particulièrement fine d'un échantillon,...


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Biophysique - Imagerie cellulaire - Histologie - Microscope optique

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  • La microscopie de fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) est basée sur l'onde d'évanescence extrêmement faible produite lorsque la lumière incidente... (source : nrc-cnrc.gc)
  • ... Pour répondre à ces contraintes nous avons développé en intégralité un système de microscopie de fluorescence en réflexion totale interne... (source : tel.archives-ouvertes)
  • imagerie de la molécule unique ; imagerie multiphoton ; imagerie cellulaire et moléculaire ; TIRFM (microscopie à fluorescence par réflexion totale interne)... (source : inb.u-bordeaux2)
Principe du TIRFM.
1. Échantillon.
2. Zone d'onde évanescente.
3. Lame porte-objet.
4. Huile d'immersion.
5. Objectif.
6. Faisceau d'émission (signal).
7. Faisceau d'excitation.

Le microscope de fluorescence par réflexion totale interne, ou TIRFM pour Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy, est un type spécifique de microscope optique à fluorescence permettant d'examiner une tranche particulièrement fine d'un échantillon (moins de 200 nm d'épaisseur), grâce à un mode d'illumination spécifique : la réflexion totale interne.

En biologie cellulaire, la plupart d'évènements moléculaires intervenant à la surface des cellules comme par exemple l'adhésion cellulaire, la fixation d'hormones sur des récepteurs de la membrane plasmique, la sécrétion de neurotransmetteurs mais aussi la dynamique membranaire (endocytose, exocytose) ont été étudiés en microscopie de fluorescence conventionnelle ou confocale. Cependant, il existe un état d'équilibre entre les molécules fluorescentes qui se lient à la surface du spécimen et celles présentes dans son environnement immédiat. Quand ces molécules sont excitées et leur fluorescence détectée par un microscope conventionnel, la fluorescence provenant des molécules liées est mélangée avec la fluorescence provenant des molécules libres qui sont le plus souvent beaucoup excédentaires.

La microscopie de fluorescence par réflexion totale interne sert à surmonter ce problème. Le principe de cet appareil est de n'exciter la fluorescence que sur une très faible profondeur, immédiatement adjacente à l'interface verre (support de l'échantillon) /eau (milieu environnant l'échantillon). L'excitation est due à une onde évanescente. Celle-ci est générée seulement lorsque la lumière incidente est complètement réfléchie à l'interface verre / eau, ce qui ne se produit que pour un certain angle d'incidence : l'angle critique, c'est la réflexion totale interne. L'échantillon est alors soumis à un champ électromagnétique sur une faible profondeur au-delà de la surface (environ 200 nm). L'intensité d'excitation de la fluorescence décroît exponentiellement selon la distance comparé à la surface. On peut ainsi en TIRFM visualiser de manière particulièrement sélective les régions de contact de la cellule avec son support (membrane basale). Il est ainsi envisageable d'étudier avec une très grande résolution la morphologie ou les évènements intervenant à la membrane plasmique de cellules vivantes.

Notes et références


Bibliographie

Liens externes

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